Systematická evoluce ligandů exponenciálním obohacením (SELEX)

Schéma hlavních fází v experimentu SELEX

Systematická evoluce ligandů exponenciálním obohacením (SELEX), známá také jako in vitro selekce nebo in vitro evoluce, je technika kombinatorické chemie v molekulární biologii. Jejím cílem je produkce oligofágních nukleotidů, ať už jednovláknové DNA nebo RNA, které se specificky vážou na cílový ligand nebo skupinu ligandů. Tyto jednovláknové DNA nebo RNA se běžně označují jako aptamery[1][2][3]. Ačkoli se SELEX stal nejčastěji používaným názvem pro tento postup, někteří výzkumníci jej dříve označovali jako SAAB (selected and amplified binding site – vybrané a amplifikované vazebné místo) a CASTing (cyclic amplification and selection of targets – cyklická amplifikace a selekce cílů)[4][5]. Metoda SELEX byla poprvé představena v roce 1990. V roce 2015 vyšlo v časopise Journal of Molecular Evolution speciální číslo na počest čtvrtstoletí od objevu SELEXu[6].

Průběh

Proces začíná syntézou oligonukleotidové knihovny. Ta se skládá z náhodně generovaných sekvencí pevné délky, ohraničených konstantními 5' a 3' konci. Tyto konstantní konce slouží jako primery, zatímco malý počet náhodných oblastí by se měl specificky vázat na zvolený cíl. Pro náhodně generovanou oblast o délce n je počet možných sekvencí v knihovně, využívající konvenční DNA nebo RNA, 4n (n pozic se čtyřmi možnostmi (A, T, C, G) na každé pozici).

Sekvence v knihovně jsou vystaveny cílovému ligandu, který může být protein nebo malá organická sloučenina. Ty sekvence, které se na cíl nenavážou, jsou odstraněny, obvykle pomocí afinitní chromatografie nebo zachycením cíle na paramagnetických kuličkách.[7] Navázané sekvence jsou poté eluovány a amplifikovány pomocí PCR[2][3], aby se připravily na následující kola selekce. Během těchto kol lze zvyšovat přísnost elučních podmínek, s cílem identifikovat sekvence s nejsilnější vazbou.[2] Je však důležité si uvědomit, že výběr entit s extrémně vysokou, sub-nanomolární vazebnou afinitou nemusí ve skutečnosti zlepšit specifitu pro cílovou molekulu.[8] Vazba mimo cíl na příbuzné molekuly by totiž mohla mít významné klinické dopady.

Reference

V tomto článku byl použit překlad textu z článku Systematic evolution of ligands by exponential enrichment na anglické Wikipedii.

  1. ↑ GASSER, G.; KOVANYI, G.; HANKE, D. Lysozymurie und Harnsteinbildung. Heidelberg: Steinkopff Dostupné online. ISBN 978-3-7985-0412-7, ISBN 978-3-642-47051-6. S. 150–151. 
  2. ↑ a b c TUERK, Craig; GOLD, Larry. Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: RNA Ligands to Bacteriophage T4 DNA Polymerase. Science. 1990-08-03, roč. 249, čís. 4968, s. 505–510. Dostupné online [cit. 2025-06-19]. ISSN 0036-8075. doi:10.1126/science.2200121. (anglicky) 
  3. ↑ a b ELLINGTON, Andrew D.; SZOSTAK, Jack W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 1990-08, roč. 346, čís. 6287, s. 818–822. Dostupné online [cit. 2025-06-19]. ISSN 0028-0836. doi:10.1038/346818a0. (anglicky) 
  4. ↑ BLACKWELL, T. Keith; WEINTRAUB, Harold. Differences and Similarities in DNA-Binding Preferences of MyoD and E2A Protein Complexes Revealed by Binding Site Selection. Science. 1990-11-23, roč. 250, čís. 4984, s. 1104–1110. Dostupné online [cit. 2025-06-19]. ISSN 0036-8075. doi:10.1126/science.2174572. (anglicky) 
  5. ↑ WRIGHT, W E; BINDER, M; FUNK, W. Cyclic amplification and selection of targets (CASTing) for the myogenin consensus binding site.. Molecular and Cellular Biology. 1991-08, roč. 11, čís. 8, s. 4104–4110. Dostupné online [cit. 2025-06-19]. ISSN 0270-7306. doi:10.1128/MCB.11.8.4104. (anglicky) 
  6. ↑ GOLD, Larry. SELEX: How It Happened and Where It will Go. Journal of Molecular Evolution. 2015-12, roč. 81, čís. 5-6, s. 140–143. Dostupné online [cit. 2025-06-19]. ISSN 0022-2844. doi:10.1007/s00239-015-9705-9. (anglicky) 
  7. ↑ STOLTENBURG, Regina; SCHUBERT, Thomas; STREHLITZ, Beate. In vitro Selection and Interaction Studies of a DNA Aptamer Targeting Protein A. PLOS ONE. 2015-07-29, roč. 10, čís. 7, s. e0134403. Dostupné online [cit. 2025-06-19]. ISSN 1932-6203. doi:10.1371/journal.pone.0134403. (anglicky) 
  8. ↑ CAROTHERS, James M.; OESTREICH, Stephanie C.; SZOSTAK, Jack W. Aptamers Selected for Higher-Affinity Binding Are Not More Specific for the Target Ligand. Journal of the American Chemical Society. 2006-06-01, roč. 128, čís. 24, s. 7929–7937. Dostupné online [cit. 2025-06-19]. ISSN 0002-7863. doi:10.1021/ja060952q. (anglicky) 

Zdroj